Pruebas de laboratorio para COVID-19: la importancia del antes y el después
Uno de los grandes retos que ha tenido la ciencia durante la pandemia de COVID-19, ha sido el de encontrar un método diagnóstico rápido y confiable. El laboratorio de biología molecular de la FCV cuenta con herramientas de última tecnología que facilitan el procesamiento de las muestras y la entrega de resultados en tiempo récord.
El desarrollo y perfeccionamiento de las diferentes pruebas de laboratorio disponibles hoy para el diagnóstico y seguimiento de pacientes, se ha logrado gracias al conocimiento del SARS-CoV-2, siendo la secuenciación del genoma la mejor forma de conocer este virus. En enero de 2020 se obtuvo la primera secuencia del virus, información que fue crucial para identificar al virus como un coronavirus, muy similar al coronavirus responsable del Síndrome Agudo Respiratorio Grave (SARS en sus siglas en inglés), enfermedad respiratoria originada en Asia en 2003, que se propagó por diversos países. Conocida la secuencia del virus y sumado a pruebas bioquímicas e imágenes de microscopía electrónica, se logró determinar que este nuevo virus posee cuatro proteínas claves (E, M, N y S), siendo la proteína S codificada por la parte más variable del genoma del coronavirus, la cual se encuentra precisamente en el dominio de unión al receptor de la proteína S, una proteína necesaria para la invasión del virus a las células de huésped (Figura 1). En humanos, este dominio proteico tiene una afinidad especial por los receptores ACE2 de las células del hospedero. Cuando los coronavirus infectan la célula, liberan en su interior el RNA viral que pude ser detectado y leído por la maquinaria celular para producir una larga cadena polipeptídica que posteriormente es fragmentada en péptidos funcionales. Otra característica encontrada en el genoma del SARS-CoV-2 es que esa cadena polipeptídica presenta un fragmento que facilita la separación de los péptidos correspondientes a la proteína S.
Figura 1. Estructura Molecular SARS-CoV2. Tomado de Nat Rev Microbiol 14, 523–534 (2016).
Una de las características de los virus RNA como el SARS-CoV-2, es que mutan rápidamente, y estas mutaciones se van acumulando en su genoma. En la figura 2 se observa un mapa dinámico, tomado de la plataforma de Nextstrain, sobre la evolución de SARS-CoV-2 a partir de las distintas secuencias que han compartido los investigadores del mundo. Hoy, se han reportado en el mundo más de 4000 genomas diferentes, por ejemplo, para Latinoamérica, como se observa en el mapa de la figura 2, la secuencia más frecuente está representada con amarillo, siendo diferente, a la encontrada en otras regiones como Norte América. Afortunadamente, gran parte de los kits utilizados para el diagnóstico de COVID-19 por medio de RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa, por su sigla en inglés de Reverse transcription polymerase chain reaction), especialmente los desarrollados después de marzo de 2020 son capaces de detectar cualquier cepa, es decir, incluso aquellas que hayan mutado. Por lo anterior, la OMS, recomienda que la RT-PCR usada con fines diagnósticos detecte como mínimo dos regiones específicas del virus, con lo cual se garantiza que si una mutación se encuentra en un sitio de reconocimiento, se tenga otra región para poder detectar el virus y dar un resultado positivo sin tener un error de diagnóstico (falso negativo) (3).
Figura 2. Mapa filogenético de relaciones genéticas entre los genomas obtenidos de personas infectadas con SARS-CoV-2. Imagen tomada de Nexstrain.org, noviembre 30 de 2020.
Tipos de Pruebas
El diagnóstico rápido pero preciso de COVID-19 es esencial para iniciar oportunamente el tratamiento adecuado, limitar una mayor propagación del virus y, en última instancia, eliminar el virus de la circulación. Las pruebas utilizadas hoy para el diagnóstico de COVID-19 se pueden clasificar en pruebas directas e indirectas. Las pruebas o test directos detectan la presencia del virus de forma directa, por lo tanto, determinan la fase de viremia de la enfermedad, mientras que las pruebas indirectas evalúan la presencia en sangre de anticuerpos, permitiendo conocer si un individuo ha estado en contacto con el virus y se encuentra inmunizado.
La prueba molecular directa, considerada el estándar de oro para el diagnóstico de COVID-19, es la RT-PCR en muestras de vías respiratorias superiores (hisopado nasofaríngeo y orofaríngeo), lavado broco alveolar y más recientemente en muestra de saliva. Esta prueba se caracteriza porque en tiempo real, de forma simultánea, puede amplificar y analizar fragmentos específicos los ácidos nucleicos, para el caso del SARS-CoV-2, RNA, en un sistema cerrado, minimizando los resultados falsos positivos asociados con la contaminación cruzada del producto de amplificación. La prueba de RT-PCR se fundamenta en el conocimiento de genoma del SARS-CoV-2, el cual es un RNA monocatenario, con una serie de dianas moleculares útiles para los ensayos de RT-PCR. El genoma del SARS-CoV-2 codifica una poliproteína (ORF1ab) involucrada en la transcripción y replicación del ARN viral, cuatro proteínas estructurales: E para la envoltura; M para la membrana; N para la nucleocápside que es necesaria para la síntesis viral y la proteína S para la espiga (Spike) (Figura 1), que permite la entrada y la infección de la célula huésped, además de cinco proteínas accesorias (ORF3a, ORF6, ORF7a, ORF8 y ORF10).
Para evitar posibles reacciones cruzadas con otros coronavirus endémicos, así como la posible deriva genética del SARS-CoV-2, se deben incluir en las pruebas de RT-PCR al menos dos dianas moleculares, una región conservada y una región específica, para mitigar los efectos de la deriva genética, especialmente a medida que el virus evoluciona dentro de nuevas poblaciones.
El rendimiento de la RT-PCR puede estar, de manera general, en un 100% de especificidad y en un 95% de sensibilidad para muestras que contengan alrededor de 100 copias virales. No obstante, la prueba puede presentar algunas dificultades, especialmente relacionadas con la recolección y procesamiento incorrectos de las muestras. Para garantizar el mejor rendimiento de la técnica y evitar la degradación del RNA, una vez recolectada la muestra de manera adecuada, los hisopos se deben sumergir en un medio de transporte y conservarse en cadena de frío, si la muestra no es procesada de manera inmediata puede ser almacenada a 2-8 °C hasta 72 h después del muestreo. Cuando el procesamiento se va a realizar 72 horas más tarde de la toma, las muestras deben almacenarse a temperaturas mucho más bajas, al menos de -70 °C. Otra dificultad en la realización de RT-PCR es el proceso de extracción de RNA, en especial para los laboratorios que realizan este paso de manera manual y no automatizada, pues requiere mucho tiempo; conlleva riesgo de contaminación cruzada entre muestras y peligro biológico para el operador; cuando el personal del laboratorio no utiliza el equipo de protección personal adecuado al manipular secreciones respiratorias de alta carga viral. Además de las dificultades técnicas mencionadas anteriormente relacionadas con el procesamiento de la RT-PCR, otra limitación de la técnica es que requiere de personal calificado, con conocimientos específicos en biología molecular y capacitación técnica especializada. El proceso se debe realizar en laboratorios acondicionados con nivel de seguridad biológica 2 (BSL-2). Si bien, la RT-PCR tiene una alta especificidad y sensibilidad, no está exenta de presentar falsos positivos; asociados con errores de manipulación y contaminación cruzada de muestras; y resultados falsos negativos, asociados con la recolección, almacenamiento y procesamiento incorrectos de la muestra.
Recientemente se encuentra en uso otra prueba directa para el diagnóstico de COVID-19, basada en la detección rápida de antígenos del SARS-CoV-2. Estos ensayos rápidos de flujo lateral proporcionan ventajas con respecto a la RT-PCR en cuanto al tiempo para obtener resultados, menor costo, no requieren personal altamente calificado ni un laboratorio de bioseguridad. No obstante, el rendimiento analítico de estas pruebas antigénicas rápidas depende de diferentes factores, incluida la carga viral, la calidad de la muestra y cómo se procesa. La sensibilidad de este test es deficiente al comienzo de la infección y dada la alta variabilidad de las cargas virales en los pacientes con COVID-19, la detección de antígenos puede pasar por alto algunos casos, debido a la baja carga infecciosa o la variabilidad del muestreo. De forma general se considera que la especificidad de estas pruebas es del 100%, pero con una sensibilidad baja del 30%. Esta baja sensibilidad da lugar a resultados falsos negativos, que en tiempo de pandemia pueden tener grandes consecuencias. Los resultados negativos deberían ser confirmados con una prueba de RT-PCR, por lo tanto, esta prueba tiene poca utilidad en un entorno pandémico.
El otro tipo de pruebas usadas en el contexto de la pandemia son las pruebas indirectas, que determinan en suero o plasma la presencia de anticuerpos, generalmente IgM e IgG. Estas pruebas son valiosas para identificar la población inmunizada, siendo las pruebas de elección en los estudios de seroprevalencia en el ámbito poblacional. Sin embargo, se debe hacer claridad que no sirven como test diagnóstico, por lo tanto, no deben utilizarse dentro de los 7 primeros días desde el inicio de los síntomas, para diagnosticar la fase aguda de la enfermedad. El mejor rendimiento de las pruebas se logra 14 días después del inicio de síntomas, con sensibilidad y especificad que en promedio puede estar ente el 88% y el 90% respectivamente, con resultados falsos negativos, pero también con resultados falsos positivos debido a anticuerpos heterófilos que pueden interferir con los inmunoensayos por un mecanismo competitivo. Estos anticuerpos heterófilos se encuentran presentes en ancianos, mujeres embarazadas y pacientes con cáncer. A pesar de su sensibilidad y especificidad limitada, las pruebas serológicas se necesitan y son valiosas para las investigaciones epidemiológicas, así como para el seguimiento de los brotes en curso por el SARS-CoV-2 y para probar los efectos de inmunogénicos de futuras vacunas.
Tanto las pruebas directas como las indirectas son valiosas, lo importante es saber cuándo hacerlas, cómo interpretarlas y quién las realiza. Una alternativa que nos permite incrementar la sensibilidad es la combinación de ambos métodos: la prueba de anticuerpos (serología para IgM e IgG) y la prueba molecular (RT-PCR). Sin duda, para el diagnóstico de COVID-19, la RT-PCR juega un papel importante en la etapa temprana de la enfermedad. Por otro lado, los anticuerpos contra el SARS-CoV-2 aparecen alrededor del día 7 al 14, después del inicio de los síntomas. Por lo tanto, una combinación de los dos ensayos incrementa la sensibilidad a cerca del 99% y conlleva a detectar y diagnosticar con certeza más pacientes con COVID-19. Por lo anterior, aunque la detección de RNA viral por RT-PCR es el estándar para el diagnóstico de infección por SARS-CoV-2, las pruebas serológicas pueden usarse como complemento a la RT-PCR para el diagnóstico de COVID-19.
Interpretación de las pruebas en el ámbito poblacional
La combinación de las pruebas moleculares y serológicas realizadas en el momento adecuado, nos permiten clasificar la población en tres grupos (Figura 3):
Cada grupo poblacional tendrá que adaptarse y seguir cuidados específicos según su condición:
- RT-PCR Negativa + anticuerpos negativos: población a riesgo, que debe guardar todas las medidas de bioseguridad para evitar contagiarse y es el grupo candidato a vacunación.
- RT-PCR positiva: población infectada y puede trasmitir la enfermedad, debe permanecer aislada y en seguimiento médico permanente.
- RT-PCR negativa + anticuerpos positivos: población apta inmunizada, población que ya puedes salir de manera segura porque ha superado la enfermedad y por lo tanto no trasmite la enfermedad.
Figura 3. Clasificación de la población según resultados de pruebas directas e indirectas
Finalmente es importante recalcar que una prueba de anticuerpos positivos aislada, sin prueba de RT-PCR, implica que el sujeto está inmunizado frente al virus, pero no indica si esta persona en ese momento es trasmisora de éste y pueda potencialmente contagiar a las personas de su entorno, para lo cual se requiere una prueba de RT-PCR.
Resultados de RT-PCR Laboratorio de Biología Molecular COVID-19 FCV
El 6 de marzo de 2020, en la ciudad de Bogotá se diagnosticó y se reportó el primer caso de COVID-19 en Colombia, en una mujer de 19 en años procedente de Italia con síntomas respiratorios. Rápidamente el virus se propaga por todo el territorio colombiano haciendo que se requieran laboratorios que colaboren con el Instituto Nacional de Salud (INS), en el diagnóstico oportuno de la infección.
La Fundación Cardiovascular de Colombia firma en el mes de mayo de 2020 un convenio de cooperación con el INS y pone en marcha el Laboratorio de Biología Molecular COVID-19 reportando los primeros resultados el 22 de mayo de 2020. Trascurridos 6 meses de trabajo, al 30 de noviembre de 2020, el laboratorio ha procesado más de 35.000 muestras (figura 4).
Figura 4. Muestras procesadas por el Laboratorio de Biología Molecular COVID-19 FCV
Gráfico 1. Pruebas RT-PCR para SARS-CoV-2 Procesadas por mes vs positivas.
Periodo comprendido entre el 22 de mayo y el 30 de noviembre de 2020.
El laboratorio ha venido incrementando mes a mes la capacidad para el procesamiento de muestras, en especial a partir del mes de agosto cuando automatizó el proceso de extracción de RNA y amplió su capacidad en máquinas de PCR. En la medida que incrementamos el número de muestras procesadas también se iba aumentando el número de resultados positivos, tendencia que cambió a partir del mes de septiembre, donde la cantidad de muestras procesadas continuó en aumento, pero los casos positivos fueron disminuyendo (Gráfico 1).
Nuestro laboratorio procesas muestras de pacientes hospitalizados, pacientes que acuden a la consulta de urgencias por síntomas compatibles con COVID-19, pacientes particulares, pero también pacientes remitidos de diferentes EPS (Entidad Promotora de Salud) que hacen tamizaje dentro de sus afiliados. El porcentaje más alto de alto de muestras positivas lo obtuvimos en el mes de agosto, como se ilustra en el gráfico 2.
A partir de la implementación de la extracción automatizada de RNA mejoramos nuestra oportunidad de entrega de resultados. Actualmente para pacientes urgentes, nuestra oportunidad de entrega es de 12 horas; para tamizajes de las diferentes EPS, 24 horas; y para código cero en trasplantes, los resultados son entregados entre 4 y 6 horas.
Gráfico 1. Pruebas RT-PCR para SARS-CoV-2 Procesadas por mes vs positivas.
Periodo comprendido entre el 22 de mayo y el 30 de noviembre de 2020.
Conclusiones
- La reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa en tiempo real (RT-PCR) en muestras respiratorias, sigue siendo el método de laboratorio recomendado actualmente para diagnosticar la infección aguda por SARS-CoV-2.
- Las pruebas serológicas para la detección de anticuerpos IgM e IgG contra el SARS-CoV-2, son importantes para las investigaciones epidemiológicas, así como para el seguimiento de los brotes de infección en curso por el SARS-CoV-2, estableciendo el porcentaje de seroprevalencia en la población (inmunidad de rebaño), y para probar los efectos de futuras vacunas.
- El uso de un método combinado (RT-PCR + pruebas serológicas IgM e IgG), para la detección de infecciones por SARS-COV-2, es una opción plausible que incrementa en alto grado la sensibilidad y especificidad, por lo que debe ser usada como una herramienta útil en el diagnóstico de pacientes sospechosos.
- Para las muestras procesadas por el laboratorio de biología molecular COVID-19 de la Fundación Cardiovascular de Colombia, el pico de mayor positividad se obtuvo en el mes de agosto.
- La automatización de los procesos en el laboratorio, en especial la extracción de RNA, reduce el riesgo de contaminación cruzada (falsos positivos) y mejora los tiempos de oportunidad de entrega de los resultados.
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MD, MSc. Directora de investigaciones y del laboratorio de biología molecular. Fundación Cardiovascular de Colombia.