Tipos de Pruebas
El diagnóstico rápido pero preciso de COVID-19 es esencial para iniciar oportunamente el tratamiento adecuado, limitar una mayor propagación del virus y, en última instancia, eliminar el virus de la circulación. Las pruebas utilizadas hoy para el diagnóstico de COVID-19 se pueden clasificar en pruebas directas e indirectas. Las pruebas o test directos detectan la presencia del virus de forma directa, por lo tanto, determinan la fase de viremia de la enfermedad, mientras que las pruebas indirectas evalúan la presencia en sangre de anticuerpos, permitiendo conocer si un individuo ha estado en contacto con el virus y se encuentra inmunizado.
La prueba molecular directa, considerada el estándar de oro para el diagnóstico de COVID-19, es la RT-PCR en muestras de vías respiratorias superiores (hisopado nasofaríngeo y orofaríngeo), lavado broco alveolar y más recientemente en muestra de saliva. Esta prueba se caracteriza porque en tiempo real, de forma simultánea, puede amplificar y analizar fragmentos específicos los ácidos nucleicos, para el caso del SARS-CoV-2, RNA, en un sistema cerrado, minimizando los resultados falsos positivos asociados con la contaminación cruzada del producto de amplificación. La prueba de RT-PCR se fundamenta en el conocimiento de genoma del SARS-CoV-2, el cual es un RNA monocatenario, con una serie de dianas moleculares útiles para los ensayos de RT-PCR. El genoma del SARS-CoV-2 codifica una poliproteína (ORF1ab) involucrada en la transcripción y replicación del ARN viral, cuatro proteínas estructurales: E para la envoltura; M para la membrana; N para la nucleocápside que es necesaria para la síntesis viral y la proteína S para la espiga (Spike) (Figura 1), que permite la entrada y la infección de la célula huésped, además de cinco proteínas accesorias (ORF3a, ORF6, ORF7a, ORF8 y ORF10).
Para evitar posibles reacciones cruzadas con otros coronavirus endémicos, así como la posible deriva genética del SARS-CoV-2, se deben incluir en las pruebas de RT-PCR al menos dos dianas moleculares, una región conservada y una región específica, para mitigar los efectos de la deriva genética, especialmente a medida que el virus evoluciona dentro de nuevas poblaciones.
El rendimiento de la RT-PCR puede estar, de manera general, en un 100% de especificidad y en un 95% de sensibilidad para muestras que contengan alrededor de 100 copias virales. No obstante, la prueba puede presentar algunas dificultades, especialmente relacionadas con la recolección y procesamiento incorrectos de las muestras. Para garantizar el mejor rendimiento de la técnica y evitar la degradación del RNA, una vez recolectada la muestra de manera adecuada, los hisopos se deben sumergir en un medio de transporte y conservarse en cadena de frío, si la muestra no es procesada de manera inmediata puede ser almacenada a 2-8 °C hasta 72 h después del muestreo. Cuando el procesamiento se va a realizar 72 horas más tarde de la toma, las muestras deben almacenarse a temperaturas mucho más bajas, al menos de -70 °C. Otra dificultad en la realización de RT-PCR es el proceso de extracción de RNA, en especial para los laboratorios que realizan este paso de manera manual y no automatizada, pues requiere mucho tiempo; conlleva riesgo de contaminación cruzada entre muestras y peligro biológico para el operador; cuando el personal del laboratorio no utiliza el equipo de protección personal adecuado al manipular secreciones respiratorias de alta carga viral. Además de las dificultades técnicas mencionadas anteriormente relacionadas con el procesamiento de la RT-PCR, otra limitación de la técnica es que requiere de personal calificado, con conocimientos específicos en biología molecular y capacitación técnica especializada. El proceso se debe realizar en laboratorios acondicionados con nivel de seguridad biológica 2 (BSL-2). Si bien, la RT-PCR tiene una alta especificidad y sensibilidad, no está exenta de presentar falsos positivos; asociados con errores de manipulación y contaminación cruzada de muestras; y resultados falsos negativos, asociados con la recolección, almacenamiento y procesamiento incorrectos de la muestra.
Recientemente se encuentra en uso otra prueba directa para el diagnóstico de COVID-19, basada en la detección rápida de antígenos del SARS-CoV-2. Estos ensayos rápidos de flujo lateral proporcionan ventajas con respecto a la RT-PCR en cuanto al tiempo para obtener resultados, menor costo, no requieren personal altamente calificado ni un laboratorio de bioseguridad. No obstante, el rendimiento analítico de estas pruebas antigénicas rápidas depende de diferentes factores, incluida la carga viral, la calidad de la muestra y cómo se procesa. La sensibilidad de este test es deficiente al comienzo de la infección y dada la alta variabilidad de las cargas virales en los pacientes con COVID-19, la detección de antígenos puede pasar por alto algunos casos, debido a la baja carga infecciosa o la variabilidad del muestreo. De forma general se considera que la especificidad de estas pruebas es del 100%, pero con una sensibilidad baja del 30%. Esta baja sensibilidad da lugar a resultados falsos negativos, que en tiempo de pandemia pueden tener grandes consecuencias. Los resultados negativos deberían ser confirmados con una prueba de RT-PCR, por lo tanto, esta prueba tiene poca utilidad en un entorno pandémico.
El otro tipo de pruebas usadas en el contexto de la pandemia son las pruebas indirectas, que determinan en suero o plasma la presencia de anticuerpos, generalmente IgM e IgG. Estas pruebas son valiosas para identificar la población inmunizada, siendo las pruebas de elección en los estudios de seroprevalencia en el ámbito poblacional. Sin embargo, se debe hacer claridad que no sirven como test diagnóstico, por lo tanto, no deben utilizarse dentro de los 7 primeros días desde el inicio de los síntomas, para diagnosticar la fase aguda de la enfermedad. El mejor rendimiento de las pruebas se logra 14 días después del inicio de síntomas, con sensibilidad y especificad que en promedio puede estar ente el 88% y el 90% respectivamente, con resultados falsos negativos, pero también con resultados falsos positivos debido a anticuerpos heterófilos que pueden interferir con los inmunoensayos por un mecanismo competitivo. Estos anticuerpos heterófilos se encuentran presentes en ancianos, mujeres embarazadas y pacientes con cáncer. A pesar de su sensibilidad y especificidad limitada, las pruebas serológicas se necesitan y son valiosas para las investigaciones epidemiológicas, así como para el seguimiento de los brotes en curso por el SARS-CoV-2 y para probar los efectos de inmunogénicos de futuras vacunas.
Tanto las pruebas directas como las indirectas son valiosas, lo importante es saber cuándo hacerlas, cómo interpretarlas y quién las realiza. Una alternativa que nos permite incrementar la sensibilidad es la combinación de ambos métodos: la prueba de anticuerpos (serología para IgM e IgG) y la prueba molecular (RT-PCR). Sin duda, para el diagnóstico de COVID-19, la RT-PCR juega un papel importante en la etapa temprana de la enfermedad. Por otro lado, los anticuerpos contra el SARS-CoV-2 aparecen alrededor del día 7 al 14, después del inicio de los síntomas. Por lo tanto, una combinación de los dos ensayos incrementa la sensibilidad a cerca del 99% y conlleva a detectar y diagnosticar con certeza más pacientes con COVID-19. Por lo anterior, aunque la detección de RNA viral por RT-PCR es el estándar para el diagnóstico de infección por SARS-CoV-2, las pruebas serológicas pueden usarse como complemento a la RT-PCR para el diagnóstico de COVID-19.